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LPS Extraction Kit 脂多糖提取試劑盒 

iNtRON17141     100 Prep

脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分。其功能包括抗吞噬、抗血清、外膜通透性屏障和作為某些噬菌體吸附受體。熱酚水提取法是提取脂多糖的常用方法，但提取時(shí)間長(zhǎng)，步驟復(fù)雜。當(dāng)我們?cè)噲D操縱如此少量的細(xì)胞時(shí)，這種方法有很大的局限性。LPS提取試劑盒是專為快速、簡(jiǎn)便地從細(xì)菌細(xì)胞中提取LPS而設(shè)計(jì)的，廣泛適用于不同的革蘭氏細(xì)菌，適合于細(xì)胞數(shù)量較少的情況。首先。細(xì)菌細(xì)胞被有機(jī)溶液溶解。細(xì)胞膜的磷脂和蛋白質(zhì)成分被破壞，細(xì)胞成分在溶液中釋放。第二步。用高鹽濃度溶液純化釋放細(xì)胞組分中的脂多糖。第三步。對(duì)于高質(zhì)量的脂多糖，洗滌和洗脫鹽通過(guò)洗滌步驟被簡(jiǎn)單地除去 。

•廣泛應(yīng)用于不同的革蘭氏陰性菌中

•僅需60分鐘即可提取出脂多糖

•可重復(fù)地獲得較高的脂多糖產(chǎn)量 

儲(chǔ)存：

在4℃下儲(chǔ)存，然后穩(wěn)定至少一年。 

試劑盒包含：

LPS Extraction Kit       100 Preps
Lysis Buffer             100 ml Purification Buffer 80 ml

使用前配制溶液 ：

70%乙醇，

室溫10mmTris-HCl緩沖液（pH8.0）

蛋白酶K溶液（30∏/ml）

LPS提取率與培養(yǎng)體積成正比當(dāng)使用5ml培養(yǎng)物時(shí)，LPS的產(chǎn)率達(dá)到大值。我們不建議處理超過(guò)5毫升的細(xì)菌培養(yǎng)物。如果使用過(guò)量的培養(yǎng)液，將降低裂解率和產(chǎn)量，增加細(xì)胞蛋白對(duì)脂多糖的污染。通常，在OD600為0.8-1.2時(shí)，宜培養(yǎng)體積為2毫升。

為從細(xì)菌細(xì)胞中獲得高純度的脂多糖，用蛋白酶K處理，按以下步驟提取脂多糖。 

協(xié)議：

1.在13000轉(zhuǎn)/分鐘的室溫下離心，獲得2-5毫升細(xì)菌細(xì)胞。注意：清除上清液的所有痕跡。對(duì)于成粒細(xì)胞，在使用前通過(guò)重復(fù)敲擊試管*松開細(xì)胞顆粒。細(xì)胞顆粒的不*松動(dòng)可能導(dǎo)致無(wú)效的溶解和降低產(chǎn)量。

2。加入1毫升裂解緩沖液，用力旋渦。注：為促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞溶解，應(yīng)大力旋渦直至細(xì)胞團(tuán)消失。

3。加入200毫升氯方后，用力旋渦10-20秒。室溫下孵育5分鐘，注意：旋渦前觀察試管。當(dāng)加入氯方時(shí)，當(dāng)氯方層向下移動(dòng)時(shí)，會(huì)在上層（藍(lán)色層）的正下方形成一條白線。這個(gè)區(qū)域包含細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、基因組DNA和RNA的混合部分。加入氯方的目的是分離酚層和水層，并終分離RNA和基因組DNA/蛋白質(zhì)。

4。以13000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速在4℃下離心10分鐘。將400毫升上清液移入新的1.5毫升試管中。注：上層移液時(shí)，注意形成白色沉淀物。

5。加入800ml純化緩沖液，充分混合。在-20℃下孵育10分鐘。注：本步驟的目的是從細(xì)胞的其他提取物（如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等）中純化脂質(zhì)6。在4℃下以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心15分鐘后，除去上層以獲得LPS顆粒。7號(hào)。加入1毫升70%乙醇，倒置試管2-3次，洗滌脂多糖顆粒。將混合物在4℃13000轉(zhuǎn)/分下離心3分鐘。丟棄上層并干燥剩余的LPS顆粒。

注：這是一個(gè)清洗階段，用于去除雜質(zhì)，如鹽等。在RT.8干燥顆粒。將30–50毫升10毫升Tris HCl緩沖液（pH 8.0）加入到LPS顆粒和渦流管或移液管中。將LPS煮沸2分鐘，使其*溶解。選擇：用蛋白酶K處理，從細(xì)菌細(xì)胞中提取高純度的LPS。每1個(gè)LPS處理2.5?蛋白酶K，在50℃孵育30分鐘。通常從大腸桿菌中提取30?LPS。         

 1.在13000轉(zhuǎn)/分鐘的室溫下離心，獲得2-5毫升細(xì)菌細(xì)胞。注意：清除上清液的所有痕跡。對(duì)于成粒細(xì)胞，在使用前通過(guò)重復(fù)敲擊試管*松開細(xì)胞顆粒。細(xì)胞顆粒的不*松動(dòng)可能導(dǎo)致無(wú)效的溶解和降低產(chǎn)量。

2。加入1毫升裂解緩沖液，用力旋渦。注：為促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞溶解，應(yīng)大力旋渦直至細(xì)胞團(tuán)消失。

3。加入200毫升氯方后，用力旋渦10-20秒。室溫下孵育5分鐘，注意：旋渦前觀察試管。當(dāng)加入氯方時(shí)，當(dāng)氯方層向下移動(dòng)時(shí)，會(huì)在上層（藍(lán)色層）的正下方形成一條白線。這個(gè)區(qū)域包含細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、基因組DNA和RNA的混合部分。加入氯方的目的是分離酚層和水層，并終分離RNA和基因組DNA/蛋白質(zhì)。

4。以13000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速在4℃下離心10分鐘。將400毫升上清液移入新的1.5毫升試管中。注：上層移液時(shí)，注意形成白色沉淀物。

5。加入800ml純化緩沖液，充分混合。在-20℃下孵育10分鐘。注：本步驟的目的是從細(xì)胞的其他提取物（如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等）中純化脂質(zhì)

6。在4℃下以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心15分鐘后，除去上層以獲得LPS顆粒。

7。加入1毫升70%乙醇，倒置試管2-3次，洗滌脂多糖顆粒。將混合物在4℃13000轉(zhuǎn)/分下離心3分鐘。丟棄上層并干燥剩余的LPS顆粒。

注：這是一個(gè)清洗階段，用于去除雜質(zhì)，如鹽等。在RT.8干燥顆粒。將30–50毫升10毫升Tris HCl緩沖液（pH 8.0）加入到LPS顆粒和渦流管或移液管中。將LPS煮沸2分鐘，使其*溶解。選擇：用蛋白酶K處理，從細(xì)菌細(xì)胞中提取高純度的LPS。每1個(gè)LPS處理2.5?蛋白酶K，在50℃孵育30分鐘。通常從大腸桿菌中提取30?LPS。

Cell culture volume(OD600=1.0) 2?(109 cells)
Yield of LPS 30?
Amount of Proteinase K 75?(2.5?of 30㎎/ ml PK)